Началась новая эра редактирования митохондриального генома

Исследователи из Центра инженерии генома Института фундаментальных наук разработали новую платформу для редактирования генов, называемую эффекторно-связанными деаминазами, подобными активатору транскрипции, или TALED. TALED — это редакторы оснований, способные выполнять преобразование оснований A в G в митохондриях. Это открытие стало кульминацией многолетнего пути к излечению генетических заболеваний человека, и TALED можно считать последней недостающей частью головоломки в технологии редактирования генов.

Начиная с идентификации первого фермента рестрикции в 1968 г., изобретения полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 1985 г. и демонстрации редактирования генома с помощью CRISPR в 2013 г., каждое новое прорывное открытие в биотехнологии еще больше улучшало нашу способность манипулировать ДНК, схема жизни. В частности, недавняя разработка системы CRISPR-Cas, или «генетических ножниц», позволила проводить всестороннее редактирование генома живых клеток. Это открыло новые возможности для лечения ранее неизлечимых генетических заболеваний путем удаления мутаций из нашего генома.

В то время как редактирование генов было в значительной степени успешным в ядерном геноме клеток, однако ученым не удалось отредактировать митохондрии, которые также имеют свой собственный геном. Митохондрии, так называемые «электростанции клеток», представляют собой крошечные органеллы в клетках, которые служат фабриками по производству энергии. Поскольку это важная органелла энергетического метаболизма, мутация гена вызывает серьезные генетические заболевания, связанные с энергетическим обменом.

Директор Центра инженерии генома Ким Джин-Су объяснил: «Существуют очень неприятные наследственные заболевания, возникающие из-за дефектов митохондриальной ДНК. Например, наследственная оптическая нейропатия Лебера (LHON), вызывающая внезапную слепоту на оба глаза, простой точечной мутацией в митохондриальной ДНК». Другое заболевание, связанное с митохондриальными генами, включает митохондриальную энцефаломиопатию с лактоацидозом и инсультоподобными эпизодами (MELAS), которая медленно разрушает мозг пациента. Некоторые исследования даже предполагают, что аномалии в митохондриальной ДНК также могут быть причиной дегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и мышечная дистрофия.

Митохондриальный геном наследуется по материнской линии. Известно 90 точечных мутаций митохондриальной ДНК, вызывающих болезни, которые в общей сложности затрагивают не менее 1 из 5000 человек. Многие существующие инструменты редактирования генома нельзя было использовать из-за ограничений метода доставки в митохондрии. Например, платформа CRISPR-Cas неприменима для редактирования этих мутаций в митохондриях, поскольку направляющая РНК не может проникнуть в саму органеллу.

«Еще одна проблема заключается в том, что существует нехватка животных моделей этих митохондриальных заболеваний. Это связано с тем, что в настоящее время невозможно сконструировать митохондриальные мутации, необходимые для создания животных моделей», — добавил директор Ким. «Отсутствие моделей на животных очень затрудняет разработку и тестирование терапевтических средств для этих заболеваний». Таким образом, надежная технология редактирования митохондриальной ДНК является одним из последних рубежей геномной инженерии, которую необходимо изучить, чтобы победить все известные генетические заболевания, и самые элитные ученые мира годами пытались воплотить ее в жизнь.

В 2020 году исследователи под руководством Дэвида Р. Лю из Института Броуда Гарварда и Массачусетского технологического института создали новый базовый редактор, названный редакторами оснований цитозина, производными от DddA (DdCBE), который может выполнять преобразование C-to-T из ДНК в митохондриях. Это стало возможным благодаря созданию новой технологии редактирования генов, называемой редактированием оснований, которая преобразует одно нуклеотидное основание в другое без нарушения ДНК. Однако и эта техника имела свои ограничения. Он не только ограничен преобразованием C в T, но и в основном ограничен мотивом TC, что делает его эффективным преобразователем TC-TT. Это означает, что он может исправить только 9 из 90 (= 10%) подтвержденных патогенных митохондриальных точечных мутаций. Долгое время считалось, что преобразование митохондриальной ДНК из A в G невозможно.

Первый автор Чо Сон-Ик сказал: «Мы начали думать о способах преодоления этих ограничений. В результате мы смогли создать новую платформу редактирования генов под названием TALED, которая может достичь преобразования A в G. Наша новая база редактор значительно расширил возможности редактирования митохондриального генома. Это может внести большой вклад не только в создание модели болезни, но и в разработку лечения». Следует отметить, что возможность выполнять преобразования A-G в одной только мтДНК человека может исправить 39 (= 43%) из 90 известных патогенных мутаций.

Исследователи создали TALED, объединив три разных компонента. Первый компонент представляет собой эффектор, подобный активатору транскрипции (TALE), который способен нацеливаться на последовательность ДНК. Вторым компонентом является TadA8e, адениндезаминаза для облегчения превращения A в G. Третий компонент, DddAtox, представляет собой цитозиндезаминазу, которая делает ДНК более доступной для TadA8e.

Одним из интересных аспектов TALED является способность TadA8e выполнять редактирование от A до G в митохондриях, которые обладают двухцепочечной ДНК (dsDNA). Это загадочное явление, поскольку TadA8e — это белок, который, как известно, специфичен только для одноцепочечной ДНК. Директор Ким сказал: «Раньше никому не приходило в голову использовать TadA8e для редактирования оснований в митохондриях, поскольку предполагается, что он специфичен только для одноцепочечной ДНК. Именно этот нестандартный подход действительно помог нам изобрести СКАЗАЛ."

Исследователи предположили, что DddAtox позволяет сделать двухцепочечную ДНК доступной за счет кратковременного раскручивания двойной цепи. Это мимолетное, но временное временное окно позволяет TadA8e, сверхбыстродействующему ферменту, быстро вносить необходимые изменения. В дополнение к настройке компонентов TALED исследователи также разработали технологию, которая позволяет одновременно редактировать базу A-to-G и C-T, а также только базовое редактирование A-to-G.

Группа продемонстрировала эту новую технологию, создав единственный клеточный клон, содержащий желаемые модификации мтДНК. Кроме того, было обнаружено, что TALED не являются цитотоксическими и не вызывают нестабильности мтДНК. Кроме того, не было нежелательного нецелевого редактирования в ядерной ДНК и очень мало нецелевых эффектов в мтДНК. Теперь исследователи стремятся к дальнейшему совершенствованию TALED за счет повышения эффективности и специфичности редактирования, что в конечном итоге проложит путь к исправлению вызывающих болезни мутаций мтДНК у эмбрионов, плодов, новорожденных или взрослых пациентов. Группа также занимается разработкой TALED, подходящих для редактирования оснований от A до G в ДНК хлоропластов, которая кодирует важные гены фотосинтеза у растений.

Уильям И. Су, научный коммуникатор Института фундаментальных наук, провозгласил: «Я считаю, что значение этого открытия сравнимо с изобретением синего светодиода, за которое в 2014 году была присуждена Нобелевская премия. Последняя часть головоломки, которая позволила нам получить высокоэффективный источник белого светодиодного света, ожидается, что TALED откроет новую эру геномной инженерии». Исследование опубликовано в Cell.

Источник